優(you)化Bio-Rad_iCycler iQ熒(ying)光定量(liang)PCR儀實(shi)驗(yan)操(cao)作(zuo)的(de)五大技(ji)巧(qiao)
Bio-Rad_iCycleriQ熒(ying)光定量(liang)PCR儀是(shi)分子生(sheng)物(wu)學(xue)中廣(guang)泛應(ying)用(yong)的(de)壹(yi)項(xiang)技(ji)術(shu)，主要(yao)用(yong)於(yu)基因表(biao)達(da)分析、病(bing)毒(du)載量(liang)檢(jian)測、基因突(tu)變檢測等(deng)方面(mian)。隨(sui)著(zhe)科(ke)研(yan)技(ji)術(shu)的(de)進步(bu)，熒(ying)光定量(liang)PCR儀器性能(neng)不(bu)斷提升，但(dan)如(ru)何優(you)化實驗操(cao)作(zuo)以獲得(de)更(geng)加(jia)準確(que)、可靠(kao)的(de)實驗結(jie)果，仍然(ran)是(shi)每個實驗人(ren)員(yuan)需(xu)要(yao)關註(zhu)的(de)重點(dian)。本(ben)文將(jiang)介紹五大技(ji)巧(qiao)，幫(bang)助優(you)化熒(ying)光定量(liang)PCR實(shi)驗(yan)操(cao)作(zuo)。
1.優(you)化引(yin)物(wu)和(he)探(tan)針的(de)設(she)計(ji)
熒(ying)光定量(liang)PCR的(de)結果高度依(yi)賴(lai)於(yu)引(yin)物(wu)和(he)探(tan)針的(de)設(she)計(ji)。引(yin)物(wu)和(he)探(tan)針的(de)特(te)異性(xing)、結(jie)合能力(li)、熔(rong)解(jie)溫度等(deng)因素(su)都(dou)會(hui)直接(jie)影(ying)響PCR的(de)效率。優(you)化設(she)計(ji)時，應(ying)該遵(zun)循(xun)以下幾(ji)個(ge)原(yuan)則(ze)：
-選擇(ze)合適的(de)引(yin)物(wu)長(chang)度和(he)GC含(han)量(liang)：通(tong)常，引(yin)物(wu)長(chang)度在(zai)18-24個(ge)堿基之(zhi)間(jian)，GC含(han)量(liang)保(bao)持(chi)在(zai)40%-60%為(wei)宜(yi)。這有助於(yu)提高引(yin)物(wu)的(de)特(te)異性(xing)和(he)擴(kuo)增效率。
-避免(mian)二聚體(ti)形成(cheng)：設(she)計(ji)時，需(xu)避免(mian)引(yin)物(wu)自身或引(yin)物(wu)間(jian)形成(cheng)二(er)聚體(ti)或發(fa)夾結(jie)構(gou)，這些(xie)都(dou)會(hui)影(ying)響擴(kuo)增效率。
-探(tan)針選擇(ze)：探(tan)針應具(ju)有高特(te)異性(xing)，且與(yu)靶(ba)標(biao)序列(lie)的(de)結合強度較(jiao)高。選擇(ze)熒(ying)光標(biao)記的(de)探(tan)針時，建(jian)議(yi)使用(yong)TaqMan探(tan)針或其(qi)他常見的(de)熒(ying)光探(tan)針。
使用(yong)專門(men)的(de)引(yin)物(wu)設(she)計(ji)軟(ruan)件(jian)（如Primer3、Oligo）可(ke)以幫助提(ti)高設(she)計(ji)的(de)準確(que)性和(he)效(xiao)果(guo)。
2.優(you)化反(fan)應(ying)體(ti)系(xi)和(he)試(shi)劑的(de)選擇(ze)
PCR反(fan)應(ying)體(ti)系(xi)的(de)組成(cheng)直接(jie)決定了實驗(yan)的(de)成(cheng)功(gong)與(yu)否。優(you)化反(fan)應(ying)體(ti)系(xi)的(de)步驟包(bao)括：
-DNA模(mo)板(ban)的(de)濃度(du)：模(mo)板(ban)的(de)濃度(du)應適中，過(guo)多(duo)或過少(shao)的(de)模(mo)板(ban)都(dou)會(hui)影(ying)響PCR反(fan)應(ying)的(de)結果。壹(yi)般(ban)來說(shuo)，DNA模(mo)板(ban)的(de)濃度(du)應控制在10-100ng範圍(wei)內。
-酶(mei)和(he)緩(huan)沖液：選擇(ze)高效的(de)熱啟(qi)動Taq酶(mei)，可以有效減(jian)少(shao)非特(te)異性(xing)擴(kuo)增。PCR緩(huan)沖液的(de)pH和(he)鹽濃度(du)應根(gen)據具體(ti)的(de)酶(mei)和(he)試(shi)劑來(lai)調節(jie)，避免(mian)因鹽濃度(du)不(bu)當導致(zhi)的(de)抑制現象。
-Mg²⁺濃度(du)：Mg²⁺是(shi)PCR反(fan)應(ying)中的(de)重要(yao)成(cheng)分(fen)，其(qi)濃度(du)需(xu)根(gen)據模(mo)板(ban)的(de)類(lei)型(xing)和(he)引(yin)物(wu)的(de)特(te)性(xing)進行(xing)調整(zheng)。過(guo)低(di)的(de)Mg²⁺濃度(du)會導致(zhi)擴(kuo)增效率低，而過高則可能引(yin)起非特(te)異性(xing)擴(kuo)增。
通(tong)過優(you)化反(fan)應(ying)體(ti)系(xi)，可(ke)以顯(xian)著(zhu)提(ti)高熒(ying)光定量(liang)PCR的(de)效率和(he)準確(que)性。
3.優(you)化PCR循(xun)環(huan)條件(jian)
熒(ying)光定量(liang)PCR的(de)反(fan)應(ying)條(tiao)件(jian)，特(te)別(bie)是(shi)溫度和(he)循(xun)環(huan)次數的(de)設(she)置(zhi)，對(dui)於(yu)實驗結(jie)果至(zhi)關重要(yao)。壹(yi)般(ban)來說(shuo)，PCR的(de)循(xun)環(huan)條件(jian)應根(gen)據所(suo)用(yong)的(de)引(yin)物(wu)、模(mo)板(ban)以及酶(mei)的(de)特(te)性(xing)進行(xing)優(you)化。以下是(shi)壹(yi)些(xie)常(chang)見的(de)優(you)化方法(fa)：
-退火(huo)溫度的(de)優(you)化：退火(huo)溫度應(ying)比(bi)引(yin)物(wu)的(de)Tm值低3-5℃，過(guo)高的(de)退火(huo)溫度會(hui)導致(zhi)擴(kuo)增效率低，過(guo)低(di)則可能導致(zhi)非特(te)異性(xing)擴(kuo)增。
-延伸(shen)時間(jian)：對(dui)於(yu)大於(yu)1000bp的(de)靶(ba)標(biao)序列(lie)，可以適當(dang)延(yan)長延(yan)伸(shen)時間(jian)，以確保(bao)DNA聚合酶(mei)有足(zu)夠(gou)的(de)時間(jian)完成(cheng)擴(kuo)增。
-循(xun)環(huan)次數：壹(yi)般(ban)建(jian)議(yi)進行(xing)25-40個循(xun)環(huan)，超過(guo)此範(fan)圍可能導致(zhi)熒(ying)光信號(hao)飽(bao)和(he)，從(cong)而影(ying)響定(ding)量(liang)結(jie)果(guo)。
使(shi)用(yong)Bio-Rad_iCycleriQ熒(ying)光定量(liang)PCR儀的(de)自動化功(gong)能(neng)，選擇(ze)適合的(de)循(xun)環(huan)條件(jian)，能夠(gou)進壹(yi)步(bu)優(you)化實驗結果(guo)。
4.使用(yong)標(biao)準曲(qu)線進行(xing)定量(liang)分(fen)析(xi)
標(biao)準曲(qu)線是(shi)熒(ying)光定量(liang)PCR中用(yong)於(yu)定量(liang)分(fen)析(xi)的(de)重要(yao)工(gong)具。為(wei)了確保定量(liang)結(jie)果(guo)的(de)準確(que)性，標(biao)準曲(qu)線必須精(jing)心(xin)準備(bei)：
-標(biao)準品(pin)的(de)選擇(ze)：標(biao)準曲(qu)線的(de)構建(jian)需(xu)要(yao)使(shi)用(yong)已(yi)知濃度(du)的(de)標(biao)準樣(yang)品，通(tong)常選用(yong)高質量(liang)的(de)質粒或基因組DNA作(zuo)為(wei)標(biao)準品(pin)。
-標(biao)準品(pin)濃度(du)的(de)梯度設(she)置(zhi)：標(biao)準曲(qu)線的(de)濃度(du)梯度需(xu)要(yao)覆(fu)蓋實(shi)驗(yan)中可(ke)能遇到的(de)模(mo)板(ban)濃度(du)範圍，通(tong)常設(she)置(zhi)5個(ge)濃度(du)點(dian)，以便更(geng)好(hao)地評(ping)估(gu)PCR的(de)線性範(fan)圍。
-重復實(shi)驗(yan)：每個(ge)標(biao)準濃度(du)點(dian)應(ying)進行(xing)三次(ci)及以上的(de)重復實(shi)驗(yan)，確保(bao)數據(ju)的(de)可靠性(xing)。
標(biao)準曲(qu)線的(de)優(you)化可以有效提(ti)高定量(liang)結(jie)果(guo)的(de)精(jing)確(que)度(du)，減(jian)少(shao)誤差(cha)。
5.優(you)化熒(ying)光信號(hao)的(de)檢測與數據(ju)分(fen)析
熒(ying)光定量(liang)PCR中的(de)熒(ying)光信號(hao)檢(jian)測與數據(ju)分(fen)析是(shi)至關重要(yao)的(de)步驟。為(wei)了提高數據(ju)的(de)質量(liang)，應(ying)註(zhu)意以下幾(ji)點(dian)：
-熒(ying)光染(ran)料的(de)選擇(ze)與校(xiao)準：選擇(ze)合適的(de)熒(ying)光染(ran)料（如(ru)SYBRGreen或TaqMan探(tan)針）並(bing)確保(bao)儀器的(de)校(xiao)準準確(que)，避免(mian)因染(ran)料效(xiao)應(ying)導致(zhi)的(de)信號偏(pian)差(cha)。
-熔(rong)解(jie)曲(qu)線分析：通(tong)過熔(rong)解(jie)曲(qu)線分析，可以有效評(ping)估(gu)PCR產物(wu)的(de)特(te)異性(xing)。若(ruo)出現多(duo)個(ge)峰(feng)值，說(shuo)明(ming)擴(kuo)增產物(wu)可(ke)能存(cun)在(zai)非特(te)異性(xing)擴(kuo)增。
-熒(ying)光信號(hao)的(de)采集：確(que)保熒(ying)光信號(hao)的(de)采集時機(ji)合適，避免(mian)在信(xin)號(hao)過(guo)早(zao)或過晚(wan)時進行(xing)數據(ju)采集。
通(tong)過優(you)化信號的(de)檢測與數據(ju)分(fen)析，可(ke)以提高熒(ying)光定量(liang)PCR的(de)精(jing)度(du)和(he)可(ke)靠(kao)性(xing)。
