蛋(dan)白純化是(shi)生物(wu)化學和分子生物(wu)學研(yan)究(jiu)中(zhong)的(de)關(guan)鍵步(bu)驟(zhou)，而(er)
GE_AKTAExplorer100蛋白(bai)純化儀(yi)的使用(yong)直(zhi)接影(ying)響實(shi)驗的(de)效率和結果的質(zhi)量。本(ben)文將(jiang)介紹蛋(dan)白(bai)純化儀(yi)的基(ji)本(ben)操作技巧，並(bing)針對常見(jian)問(wen)題提(ti)供解(jie)決(jue)方(fang)案(an)，幫(bang)助(zhu)研(yan)究(jiu)人(ren)員提(ti)高實(shi)驗成(cheng)功率。
壹、GE_AKTAExplorer100蛋(dan)白純化儀(yi)的基(ji)本(ben)操作技巧
1.樣(yang)品(pin)準(zhun)備(bei)
-樣(yang)品(pin)澄清(qing)：在純化前(qian)，需通過(guo)離(li)心(xin)或(huo)過濾(lv)去除(chu)細(xi)胞(bao)碎片和不溶性(xing)雜質(zhi)，避免(mian)堵塞層析(xi)柱(zhu)。
-緩沖(chong)液匹(pi)配：確(que)保(bao)樣(yang)品(pin)緩沖(chong)液的pH、離(li)子(zi)強(qiang)度和成分與層析(xi)柱(zhu)的平(ping)衡(heng)緩沖(chong)液壹致(zhi)，以(yi)減少非(fei)特異(yi)性(xing)結合。
2.層(ceng)析(xi)柱(zhu)的選(xuan)擇(ze)與平衡(heng)
-選(xuan)擇(ze)合適(shi)的層(ceng)析(xi)柱(zhu)：根據目標蛋(dan)白的特性(xing)選(xuan)擇(ze)親(qin)和層析(xi)、離(li)子(zi)交(jiao)換(huan)層析(xi)或(huo)分子篩層(ceng)析(xi)等。
-充分平衡(heng)：在進(jin)樣(yang)前(qian)，用(yong)至少5-10倍柱(zhu)體積的緩沖(chong)液平衡(heng)層析(xi)柱(zhu)，確(que)保(bao)pH和離(li)子(zi)強(qiang)度穩(wen)定。
3.上(shang)樣(yang)與洗脫(tuo)
-控制流速：上(shang)樣(yang)時流速不(bu)宜(yi)過(guo)快，避免(mian)蛋(dan)白(bai)未充分結合就(jiu)流失。通常建(jian)議(yi)流速為(wei)0.5-2mL/min（視(shi)柱(zhu)體積而(er)定）。
-梯(ti)度洗(xi)脫(tuo)優化：對於(yu)離(li)子(zi)交(jiao)換(huan)層析(xi)，可采(cai)用線性(xing)或(huo)階梯(ti)式鹽梯(ti)度洗(xi)脫(tuo)，提(ti)高分辨(bian)率。
4.收(shou)集與檢測
-分步(bu)收(shou)集(ji)：使用(yong)自(zi)動(dong)餾分收集器(qi)，按(an)時間或(huo)體積分段(duan)收集洗(xi)脫(tuo)液，便於(yu)後(hou)續(xu)分析(xi)。
-實(shi)時監測：利(li)用(yong)UV檢(jian)測器(qi)（280nm）監測蛋(dan)白峰，確(que)保(bao)目(mu)標蛋(dan)白的準確(que)收(shou)集(ji)。
5.層析(xi)柱(zhu)的維(wei)護
-及(ji)時清(qing)洗(xi)：每(mei)次(ci)使用(yong)後(hou)，用高鹽（如1MNaCl）或(huo)低(di)pH緩沖(chong)液清(qing)洗(xi)層(ceng)析(xi)柱(zhu)，去除(chu)殘(can)留蛋(dan)白。
-正(zheng)確(que)保(bao)存(cun)：長期不用(yong)時，層析(xi)柱(zhu)應(ying)保(bao)存(cun)在20%乙醇(chun)或(huo)專用保存(cun)緩沖(chong)液中(zhong)，防(fang)止(zhi)微生物(wu)生(sheng)長。
二(er)、常見(jian)問(wen)題及(ji)解(jie)決(jue)方(fang)案(an)
1.層(ceng)析(xi)柱(zhu)堵塞
-可能原因(yin)：樣(yang)品(pin)含(han)有顆粒物或(huo)沈(chen)澱。
-解(jie)決(jue)方(fang)案(an)：
-上(shang)樣(yang)前(qian)高速離(li)心(xin)（12,000rpm，10min）或(huo)0.22μm濾(lv)膜(mo)過濾(lv)。
-若(ruo)已(yi)堵塞，可反(fan)向沖(chong)洗(xi)層(ceng)析(xi)柱(zhu)，或(huo)更換(huan)篩板。
2.蛋白(bai)回收(shou)率低(di)
-可能(neng)原因(yin)：
-蛋(dan)白(bai)未結合（緩沖(chong)液不匹(pi)配）。
-洗脫(tuo)條件(jian)過(guo)強(qiang)，導致(zhi)蛋(dan)白失活。
-解(jie)決(jue)方(fang)案(an)：
-優化結合緩沖(chong)液的pH和離(li)子(zi)強(qiang)度。
-采(cai)用溫和洗脫(tuo)條件(jian)（如(ru)降低(di)洗脫(tuo)鹽濃(nong)度或(huo)延(yan)長梯(ti)度時間）。
3.洗(xi)脫(tuo)峰拖尾(wei)
-可(ke)能原因(yin)：
-蛋(dan)白(bai)與層析(xi)介質(zhi)非特異(yi)性(xing)結合。
-洗(xi)脫(tuo)梯(ti)度不(bu)夠陡峭。
-解(jie)決(jue)方(fang)案(an)：
-在緩沖(chong)液中(zhong)加(jia)入(ru)去垢劑或(huo)競爭性(xing)洗脫(tuo)劑。
-優化洗脫(tuo)梯(ti)度，提(ti)高分辨(bian)率。
4.基(ji)線漂(piao)移或(huo)噪(zao)音(yin)大(da)
-可能(neng)原因(yin)：
-緩沖(chong)液未充分脫(tuo)氣(qi)，導(dao)致(zhi)氣(qi)泡(pao)進(jin)入檢測器(qi)。
-UV檢測器(qi)汙(wu)染(ran)或(huo)光源(yuan)不穩(wen)定。
-解(jie)決(jue)方(fang)案(an)：
-使用(yong)前(qian)對緩沖(chong)液進(jin)行(xing)脫(tuo)氣(qi)處(chu)理(li)。
-定期清(qing)潔(jie)檢(jian)測器(qi)流通池(chi)，檢(jian)查光(guang)源(yuan)壽(shou)命。
5.蛋白聚(ju)集或(huo)沈(chen)澱
-可(ke)能(neng)原因(yin)：
-純化過(guo)程中(zhong)蛋(dan)白(bai)濃(nong)度過(guo)高。
-緩沖(chong)液成分不合適(shi)（如pH偏(pian)離(li)等(deng)電(dian)點(dian)）。
-解(jie)決(jue)方(fang)案(an)：
-降(jiang)低(di)蛋白(bai)濃(nong)度，或(huo)添加(jia)穩(wen)定劑（如(ru)甘(gan)油(you)、DTT）。
-調(tiao)整(zheng)緩沖(chong)液pH，避免蛋(dan)白(bai)在等電(dian)點(dian)附(fu)近沈(chen)澱。
6.層(ceng)析(xi)柱(zhu)壽(shou)命短(duan)
-可能原(yuan)因(yin)：
-未正(zheng)確(que)清(qing)洗(xi)和保存(cun)層(ceng)析(xi)柱(zhu)。
-樣(yang)品(pin)中(zhong)含(han)有蛋白酶或(huo)核酸汙(wu)染(ran)。
-解(jie)決(jue)方(fang)案(an)：
-每(mei)次(ci)使用(yong)後(hou)清(qing)洗(xi)，並(bing)嚴格按(an)廠商(shang)建(jian)議(yi)保(bao)存(cun)。
-在樣(yang)品(pin)中(zhong)添加(jia)蛋(dan)白(bai)酶(mei)抑(yi)制劑或(huo)核酸酶。
