在(zai)實(shi)驗準(zhun)備(bei)階段，耗(hao)材的(de)選(xuan)擇(ze)至(zhi)關(guan)重(zhong)要(yao)。推(tui)薦使(shi)用低吸(xi)附(fu)的(de)PCR管或96孔板(ban)，並(bing)確(que)保管蓋(gai)閉(bi)合。反應(ying)體系(xi)的(de)配制需要(yao)在(zai)冰(bing)上進行，各(ge)組(zu)分要(yao)充(chong)分混(hun)勻(yun)。引物和探針的(de)濃(nong)度需(xu)要(yao)優(you)化，通常引物終濃(nong)度為(wei)0.2-0.5μM，探(tan)針終濃(nong)度為(wei)0.1-0.2μM。模(mo)板(ban)DNA的(de)加(jia)入(ru)量(liang)建(jian)議(yi)在(zai)1-100ng之間(jian)，過(guo)高可(ke)能導(dao)致擴(kuo)增(zeng)效率下降。

 

　　程序(xu)設置(zhi)是實(shi)驗成(cheng)功(gong)的(de)關(guan)鍵(jian)。退(tui)火(huo)溫(wen)度需(xu)要(yao)根(gen)據(ju)引物的(de)Tm值(zhi)確(que)定(ding)，通常比Tm低3-5℃。延伸(shen)時間(jian)根(gen)據(ju)擴增(zeng)片段(duan)長度設(she)置(zhi)，壹般(ban)按(an)每(mei)分鐘延伸1kb計(ji)算(suan)。建(jian)議(yi)設(she)置(zhi)熔(rong)解曲(qu)線分析步(bu)驟(zhou)，以(yi)驗證擴增(zeng)特異性(xing)。對於多重(zhong)PCR，需(xu)要(yao)仔(zai)細(xi)優(you)化各(ge)通道的(de)熒(ying)光(guang)采集(ji)溫度，避(bi)免(mian)信號(hao)幹擾。

 

　　數據分析時(shi)，要(yao)正(zheng)確(que)設置(zhi)基線範圍和閾值(zhi)線。基線通常選(xuan)擇(ze)3-15個(ge)循(xun)環(huan)，閾(yu)值(zhi)線設置在指數擴增(zeng)期的(de)線(xian)性(xing)範(fan)圍內(nei)。對於相(xiang)對定(ding)量(liang)，需要(yao)選(xuan)擇(ze)合適的(de)內(nei)參基因，並(bing)使(shi)用ΔΔCt法(fa)計(ji)算(suan)目標(biao)基因的(de)相(xiang)對表達(da)量(liang)。絕對定(ding)量(liang)則需要(yao)建(jian)立標(biao)準(zhun)曲(qu)線，確(que)保擴(kuo)增(zeng)效率在(zai)90%-110%之間(jian)。

 

　　儀器維護(hu)不(bu)容(rong)忽(hu)視(shi)。每月清潔(jie)樣品槽和光(guang)學系(xi)統，使(shi)用無(wu)水(shui)乙(yi)醇(chun)擦拭(shi)樣(yang)品槽，用鏡(jing)頭(tou)紙(zhi)清潔(jie)光(guang)學元(yuan)件(jian)。每(mei)季(ji)度校(xiao)準(zhun)溫(wen)度控(kong)制系(xi)統，使(shi)用專(zhuan)用(yong)校(xiao)準(zhun)試(shi)劑(ji)盒(he)驗(yan)證(zheng)各(ge)孔溫度準(zhun)確(que)性。每(mei)年(nian)進(jin)行全(quan)面的(de)光(guang)學系(xi)統校(xiao)準(zhun)，確(que)保熒(ying)光(guang)檢測(ce)的(de)靈敏度和準(zhun)確(que)性。

 

　　掌(zhang)握(wo)這(zhe)些(xie)操(cao)作(zuo)技(ji)巧(qiao)，就(jiu)能充分發(fa)揮(hui)Bio-Rad_iCycleriQ熒(ying)光(guang)定(ding)量(liang)PCR儀的(de)性(xing)能，獲得(de)可(ke)靠的(de)實(shi)驗數據。隨著使(shi)用經(jing)驗(yan)的(de)積(ji)累，實(shi)驗人(ren)員還(hai)能根(gen)據(ju)具體研究需(xu)求，開發(fa)出(chu)更(geng)優(you)化的(de)實(shi)驗方(fang)案。