壹、測序(xu)原(yuan)理(li)

 

　　ABI_3500測序(xu)儀采用的(de)是熒(ying)光(guang)標記的(de)鏈終(zhong)止法（Sanger測序法）。該方法的(de)基本(ben)原(yuan)理(li)是利用四(si)種不同的(de)熒光(guang)標記的(de)脫氧(yang)核苷酸（dNTPs）合(he)成DNA鏈。在DNA合成過(guo)程(cheng)中(zhong)，隨(sui)機摻入(ru)壹種熒(ying)光(guang)標記的(de)鏈終(zhong)止核(he)苷酸，導(dao)致合(he)成的(de)DNA鏈在特(te)定位置終(zhong)止(zhi)。通(tong)過(guo)電(dian)泳(yong)分(fen)離(li)不同長(chang)度的(de)DNA片段，並(bing)利用激(ji)光(guang)激(ji)發熒光(guang)信號(hao)，測(ce)序(xu)儀能(neng)夠讀(du)取(qu)每個(ge)片段的(de)序列信(xin)息。

 

　　二(er)、操作(zuo)步(bu)驟(zhou)

 

　　1.樣品(pin)準(zhun)備(bei)

 

　　在進行(xing)測序(xu)之前(qian)，首(shou)先(xian)需要(yao)提取(qu)和純(chun)化(hua)DNA樣(yang)品(pin)。確保樣(yang)品(pin)的(de)濃度(du)和純(chun)度符合測(ce)序要(yao)求。通(tong)常(chang)，使用納(na)米(mi)滴定儀（NanoDrop）測定DNA濃度(du)，並(bing)通(tong)過(guo)瓊(qiong)脂(zhi)糖凝(ning)膠(jiao)電(dian)泳(yong)檢(jian)查(zha)DNA的(de)完整性(xing)。

 

　　2.反應體系配置

 

　　根(gen)據(ju)ABI3500的(de)操作(zuo)手冊，配置PCR反(fan)應(ying)體系。壹般包括DNA模板(ban)、引物(wu)、dNTPs、DNA聚(ju)合(he)酶和緩沖液(ye)。確保所有(you)試劑(ji)均(jun)為新(xin)鮮(xian)且未(wei)過(guo)期(qi)。

 

　　3.PCR擴(kuo)增(zeng)

 

　　將配置好的(de)反應(ying)體系放(fang)入(ru)PCR儀中，進(jin)行擴(kuo)增(zeng)。設定合適(shi)的(de)循環(huan)條件(jian)，包括變性(xing)、退火和延(yan)伸(shen)溫(wen)度(du)及時間(jian)。擴(kuo)增(zeng)完成後，使用瓊脂糖凝(ning)膠(jiao)電(dian)泳(yong)確認PCR產(chan)物(wu)的(de)大(da)小(xiao)和純(chun)度。

 

　　4.測(ce)序(xu)反(fan)應

 

　　將PCR產(chan)物(wu)進(jin)行(xing)測(ce)序反應。將擴(kuo)增(zeng)產(chan)物(wu)與(yu)熒(ying)光(guang)標記的(de)鏈終(zhong)止核(he)苷酸和DNA聚(ju)合(he)酶混(hun)合，進行測序(xu)反(fan)應。反應(ying)結束後(hou)，使用酶切(qie)或純化(hua)方(fang)法去除未(wei)反應(ying)的(de)核苷酸。

 

　　5.電(dian)泳(yong)分(fen)離(li)

 

　　將純化(hua)後(hou)的(de)樣品(pin)加載到ABI3500的(de)毛細管中，進行(xing)電(dian)泳(yong)分(fen)離(li)。儀器會(hui)根據(ju)DNA片段的(de)大(da)小(xiao)和熒(ying)光(guang)信號(hao)進(jin)行(xing)實時監測。

 

　　6.數(shu)據(ju)分析

 

　　電泳(yong)結束後(hou)，使用ABI3500附(fu)帶的(de)軟件(jian)進行(xing)數(shu)據(ju)分析。軟件會自動(dong)識(shi)別(bie)熒(ying)光(guang)信號(hao)並(bing)生(sheng)成測序(xu)結果。用戶可以(yi)根(gen)據需要(yao)導出(chu)序列數(shu)據(ju)，並進行後(hou)續分(fen)析。

 

　　三、註意(yi)事(shi)項(xiang)

 

　　1.樣品(pin)質量

 

　　樣品(pin)的(de)質量直接(jie)影(ying)響測序結果。確保DNA樣(yang)品(pin)無汙染，且(qie)濃度(du)適(shi)中。

 

　　2.試劑(ji)選(xuan)擇

 

　　使用高質量的(de)試劑(ji)和耗(hao)材，避(bi)免因(yin)試劑(ji)問題導(dao)致的(de)測序(xu)失敗。

 

　　3.儀器維(wei)護(hu)

 

　　定期對(dui)ABI3500進行(xing)維(wei)護(hu)和校(xiao)準(zhun)，確保儀器的(de)穩(wen)定性和準(zhun)確性。

 

　　4.數(shu)據(ju)存儲

 

　　測(ce)序數(shu)據(ju)應及時備(bei)份，避(bi)免因(yin)數(shu)據(ju)丟失影(ying)響後續研(yan)究。