工(gong)作(zuo)原理(li)

 

　　BD_FACSCalibur流(liu)式細(xi)胞儀(yi)的(de)核(he)心(xin)原理(li)是(shi)利用激(ji)光(guang)束(shu)照(zhao)射單(dan)個細(xi)胞，並通(tong)過檢(jian)測散(san)射光(guang)和(he)熒光信號來分析(xi)細(xi)胞的(de)物理(li)和(he)生化特性。其(qi)基(ji)本工(gong)作(zuo)流(liu)程如下(xia)：

 

　　1.樣本制備：待(dai)測細(xi)胞或(huo)微(wei)粒(li)被熒光標(biao)記（如抗(kang)體偶(ou)聯(lian)熒光染料）後(hou)制成(cheng)單(dan)細(xi)胞懸(xuan)液(ye)。

 

　　2.流(liu)體聚(ju)焦(jiao)：樣(yang)本通(tong)過鞘液(ye)包裹，形(xing)成(cheng)單(dan)細(xi)胞流(liu)，確保細(xi)胞逐(zhu)個(ge)通(tong)過檢(jian)測區。

 

　　3.激(ji)光(guang)激(ji)發(fa)：細(xi)胞流(liu)經激(ji)光(guang)束(shu)時，熒光染料被激(ji)發(fa)並發(fa)射(she)特(te)定(ding)波(bo)長的(de)光。

 

　　4.信號檢測：

 

　　-前向散(san)射光(guang)（FSC）：反(fan)映(ying)細(xi)胞大小(xiao)。

 

　　-側(ce)向散(san)射光(guang)（SSC）：反(fan)映(ying)細(xi)胞內(nei)部(bu)復(fu)雜(za)度(du)（如顆(ke)粒度(du)）。

 

　　-熒光信號：反(fan)映(ying)特定(ding)分子（如表(biao)面標(biao)誌物(wu)、胞內(nei)蛋(dan)白(bai)）的(de)表(biao)達(da)水平。

 

　　5.數據分析(xi)：計算機(ji)系統(tong)收(shou)集信號，通(tong)過軟(ruan)件(jian)（如FlowJo、FCSExpress）進(jin)行統(tong)計和(he)可(ke)視(shi)化分析(xi)。

 

　　在(zai)細(xi)胞表(biao)型分析(xi)中的(de)應(ying)用(yong)

 

　　細(xi)胞表(biao)型分析(xi)是(shi)流(liu)式細(xi)胞儀(yi)經典(dian)的(de)應(ying)用(yong)之(zhi)壹(yi)，主要用(yong)於(yu)鑒定(ding)和(he)分類(lei)不同細(xi)胞亞(ya)群(qun)。例如：

 

　　1.免(mian)疫細(xi)胞分型

 

　　在(zai)免(mian)疫(yi)學(xue)研究中，流(liu)式細(xi)胞儀(yi)可(ke)區(qu)分T細(xi)胞（CD3+）、B細(xi)胞（CD19+）、NK細(xi)胞（CD56+）等，並進(jin)壹(yi)步(bu)細(xi)分亞(ya)群(qun)（如CD4+輔(fu)助T細(xi)胞和(he)CD8+細(xi)胞毒(du)性T細(xi)胞）。通(tong)過多色熒光標(biao)記（如10色以(yi)上流(liu)式），可(ke)以(yi)同時分析(xi)多種(zhong)表(biao)面標(biao)誌物(wu)，揭(jie)示(shi)免(mian)疫(yi)系(xi)統的(de)精細(xi)調(tiao)控(kong)機制。

 

　　2.腫瘤(liu)細(xi)胞鑒定(ding)

 

　　在(zai)白(bai)血病(bing)和(he)淋巴(ba)瘤(liu)診斷(duan)中，流(liu)式細(xi)胞儀(yi)通(tong)過檢(jian)測腫瘤(liu)特(te)異(yi)性抗原(yuan)（如CD34、CD19、CD5）輔(fu)助分型。例如，急性髓系(xi)白(bai)血病(bing)（AML）細(xi)胞可(ke)能高(gao)表(biao)達(da)CD33和(he)CD117，而慢(man)性淋巴(ba)細(xi)胞白(bai)血病(bing)（CLL）細(xi)胞則(ze)常(chang)表(biao)達(da)CD5和(he)CD23。

 

　　3.幹細(xi)胞研究

 

　　流(liu)式細(xi)胞儀(yi)可(ke)用(yong)於(yu)分離(li)和(he)鑒定(ding)幹細(xi)胞（如CD34+造(zao)血幹(gan)細(xi)胞），並監(jian)測其(qi)分化狀(zhuang)態(tai)。結合(he)轉錄因子（如OCT4、SOX2）的(de)胞內(nei)染(ran)色，可(ke)評(ping)估(gu)幹細(xi)胞的(de)“幹性”維(wei)持情況。

 

　　在(zai)細(xi)胞功(gong)能分析(xi)中的(de)應(ying)用(yong)

 

　　除(chu)了(le)表(biao)型分析(xi)，流(liu)式細(xi)胞儀(yi)還能動(dong)態(tai)監(jian)測細(xi)胞功(gong)能，包括：

 

　　1.細(xi)胞周期與(yu)增(zeng)殖

 

　　通(tong)過DNA染(ran)料（如PI、DAPI）染(ran)色，流(liu)式細(xi)胞儀(yi)可(ke)分析(xi)細(xi)胞周期分布(bu)（G0/G1、S、G2/M期）。此外(wai)，增(zeng)殖染料（如CFSE）可(ke)追(zhui)蹤細(xi)胞分裂(lie)次(ci)數。

 

　　2.細(xi)胞雕亡(wang)與(yu)死亡(wang)

 

　　AnnexinV-FITC/PI雙(shuang)染(ran)可(ke)區(qu)分早(zao)期雕亡(wang)（AnnexinV+PI−）和(he)晚(wan)期雕亡(wang)/壞(huai)死（AnnexinV+PI+）。Caspase活(huo)性檢測則進壹步(bu)揭(jie)示(shi)雕亡(wang)通(tong)路激(ji)活(huo)情(qing)況(kuang)。

 

　　3.細(xi)胞內(nei)細(xi)胞因子與(yu)信號通(tong)路

 

　　通(tong)過破膜(mo)固定(ding)技術(shu)，可(ke)檢(jian)測胞內(nei)因子（如IFN-γ、IL-2）或(huo)磷酸化蛋白(bai)（如p-STAT3），評(ping)估(gu)免疫(yi)細(xi)胞的(de)功能狀(zhuang)態(tai)。例(li)如，Th1/Th2細(xi)胞因子的(de)平衡(heng)分析(xi)有助於(yu)理(li)解自(zi)身免疫(yi)疾(ji)病(bing)機(ji)制。

 

　　4.鈣(gai)流(liu)與(yu)活性氧（ROS）檢測

 

　　熒光探針(zhen)（如Fluo-3、DCFH-DA）可(ke)實(shi)時監測細(xi)胞內(nei)鈣(gai)離(li)子濃度(du)或(huo)氧化應(ying)激(ji)水平，用於(yu)藥(yao)理(li)學(xue)或(huo)毒(du)理(li)學(xue)研究。

 

　　技術(shu)進展

 

　　近(jin)年(nian)來，BD_FACSCalibur流(liu)式細(xi)胞儀(yi)技術(shu)不斷(duan)革新，主要包括：

 

　　1.質(zhi)譜(pu)流(liu)式（CyTOF）：用(yong)金屬同位素(su)替(ti)代(dai)熒光染料，突(tu)破傳(chuan)統熒光通(tong)道(dao)限(xian)制，實現(xian)40+參數檢測。

 

　　2.光譜流(liu)式：通(tong)過全(quan)光(guang)譜解析(xi)，減少熒光串擾，提高多色實驗準(zhun)確性。

 

　　3.成(cheng)像流(liu)式：結合(he)顯微(wei)鏡(jing)功能，在(zai)獲取熒光數據的(de)同時記錄(lu)細(xi)胞形(xing)態(tai)。

 

　　4.微(wei)流(liu)控(kong)芯片：實(shi)現(xian)低(di)成(cheng)本、便(bian)攜(xie)式細(xi)胞分析(xi)，適用於(yu)床邊(bian)檢(jian)測（POCT）。