壹(yi)、熒(ying)光定量(liang)PCR技(ji)術概述(shu)

 

　　熒(ying)光定量(liang)PCR（QuantitativePCR，qPCR）是(shi)壹種用於(yu)定量(liang)分(fen)析特定DNA或(huo)RNA樣(yang)本的(de)技(ji)術。與(yu)傳統(tong)的(de)PCR技(ji)術不(bu)同(tong)，qPCR通過實(shi)時(shi)監測擴(kuo)增過程中(zhong)產(chan)生的(de)熒(ying)光信(xin)號來定量(liang)分(fen)析DNA或RNA的(de)濃度。此技(ji)術通過在(zai)PCR反應體(ti)系中(zhong)加(jia)入(ru)熒(ying)光探(tan)針(zhen)或染(ran)料，利(li)用熒(ying)光信(xin)號強度的(de)變化(hua)來評(ping)估(gu)目(mu)標(biao)基(ji)因的(de)擴增過程。

 

　　在qPCR過(guo)程中(zhong)，PCR擴(kuo)增產(chan)物(wu)的(de)熒(ying)光信(xin)號會隨(sui)著擴(kuo)增反應的(de)進行而增加(jia)，儀(yi)器(qi)通過監(jian)測熒(ying)光信(xin)號的(de)變化(hua)，結(jie)合(he)標(biao)準(zhun)曲(qu)線，能(neng)夠精(jing)確地計算(suan)出(chu)樣(yang)本中(zhong)目(mu)標(biao)基(ji)因的(de)相(xiang)對或(huo)絕對濃度。

 

　　二、工作(zuo)原(yuan)理(li)

 

　　ABI_7500熒(ying)光定量(liang)PCR儀(yi)是通過實(shi)時(shi)監測熒(ying)光信(xin)號的(de)變化(hua)來實(shi)現(xian)PCR反應的(de)定量(liang)分(fen)析。其基(ji)本工(gong)作(zuo)原(yuan)理(li)包(bao)括以(yi)下(xia)幾個核(he)心(xin)步驟(zhou)：

 

　　1.PCR反應體(ti)系的(de)建立：首(shou)先(xian)，研(yan)究人員(yuan)需(xu)將(jiang)DNA樣本(ben)、特異性(xing)引(yin)物(wu)、熒(ying)光染(ran)料（如(ru)SYBRGreen）或熒(ying)光探(tan)針(zhen)（如TaqMan探(tan)針(zhen)）加(jia)入(ru)PCR反應體(ti)系中(zhong)。PCR反應體(ti)系的(de)組(zu)分(fen)通常(chang)還包(bao)括緩(huan)沖(chong)液、dNTPs、DNA聚(ju)合酶(mei)等。

 

　　2.熱循環(huan)反應：PCR反應通過溫(wen)控系(xi)統進(jin)行熱循環，通常(chang)包(bao)括三個階段：變性(xing)（95°C），退(tui)火(huo)（55-65°C），延(yan)伸(shen)（72°C）。在每個(ge)擴增周(zhou)期(qi)結(jie)束(shu)後，儀器(qi)會通過光學系(xi)統(tong)實(shi)時(shi)檢測熒(ying)光信(xin)號的(de)變化(hua)。

 

　　3.熒(ying)光信(xin)號的(de)采集：隨(sui)著DNA擴(kuo)增的(de)進行，PCR產(chan)物(wu)數量(liang)逐(zhu)漸(jian)增加(jia)，熒(ying)光染(ran)料或(huo)熒(ying)光探(tan)針(zhen)在PCR產(chan)物(wu)上(shang)結(jie)合(he)並(bing)發(fa)出(chu)熒(ying)光。ABI7500儀(yi)器(qi)通過光學模(mo)塊(kuai)檢測反應管(guan)內的(de)熒(ying)光強度，並在每個(ge)循環結(jie)束(shu)時(shi)記(ji)錄熒(ying)光值(zhi)。

 

　　4.數(shu)據分(fen)析(xi)：熒(ying)光信(xin)號的(de)強度與(yu)PCR產(chan)物(wu)的(de)數量(liang)成(cheng)正(zheng)比(bi)。通過監(jian)測熒(ying)光信(xin)號的(de)變化(hua)，ABI7500能(neng)夠計算(suan)出(chu)PCR擴(kuo)增曲線的(de)閾值(zhi)循(xun)環(huan)數（Ct值）。Ct值(zhi)與(yu)目(mu)標(biao)DNA的(de)初始濃度相(xiang)關，較(jiao)低(di)的(de)Ct值意味(wei)著樣(yang)本中(zhong)目(mu)標(biao)基(ji)因的(de)初始濃度較高(gao)。

 

　　5.結(jie)果(guo)解(jie)讀(du)：能(neng)夠自動生成(cheng)擴(kuo)增曲線圖和標準曲線，通過比(bi)對(dui)未知樣品的(de)Ct值與(yu)標準曲線，得(de)到(dao)目(mu)標(biao)基(ji)因的(de)定量(liang)數(shu)據。對(dui)於(yu)定量(liang)表(biao)達分(fen)析(xi)，還可(ke)以(yi)通過相(xiang)對定量(liang)（ΔΔCt法(fa)）來計算(suan)樣(yang)本(ben)中(zhong)目(mu)標(biao)基(ji)因與(yu)內參(can)基(ji)因的(de)表(biao)達水平(ping)變化(hua)。

 

　　三、ABI_7500熒(ying)光定量(liang)PCR儀(yi)的(de)技(ji)術核心(xin)

 

　　1.高(gao)效的(de)熱循(xun)環(huan)系(xi)統：配備(bei)了(le)精(jing)準(zhun)的(de)熱循(xun)環(huan)模(mo)塊，可(ke)以(yi)快(kuai)速(su)、均(jun)勻(yun)地控制(zhi)溫(wen)度變化(hua)，保證PCR反應的(de)高(gao)效性(xing)和(he)壹(yi)致(zhi)性(xing)。該系統(tong)確保每個(ge)擴增周(zhou)期(qi)都能(neng)夠實(shi)現(xian)最(zui)佳(jia)的(de)反應條(tiao)件，從(cong)而提高(gao)了(le)結(jie)果(guo)的(de)可(ke)靠性(xing)。

 

　　2.精(jing)確的(de)熒(ying)光檢測：采用(yong)高(gao)性(xing)能(neng)的(de)光學系(xi)統(tong)，能(neng)夠實(shi)時(shi)監測每個(ge)反應管(guan)內的(de)熒(ying)光信(xin)號。其采用(yong)了(le)多通道熒(ying)光檢測，支(zhi)持(chi)SYBRGreen、TaqMan探針(zhen)等多(duo)種熒(ying)光探(tan)針(zhen)或染(ran)料的(de)應用(yong)，具(ju)有(you)靈敏(min)度高(gao)、背景(jing)低(di)、信號穩(wen)定等(deng)優點(dian)。

 

　　3.多(duo)重反應能(neng)力(li)：能(neng)夠進行多重PCR反應，即(ji)在(zai)同(tong)壹反應體(ti)系中(zhong)同(tong)時檢測多(duo)個(ge)目(mu)標(biao)基(ji)因。通過使(shi)用不(bu)同(tong)熒(ying)光染(ran)料或(huo)探針(zhen)，研(yan)究人員(yuan)可(ke)以(yi)在壹(yi)個(ge)反應管(guan)中(zhong)檢測多(duo)個(ge)目(mu)標(biao)，節省(sheng)實(shi)驗(yan)成本和(he)時間。

 

　　4.數據分(fen)析(xi)與(yu)結(jie)果(guo)導(dao)出：配(pei)備了(le)功(gong)能(neng)強大(da)的(de)分析(xi)軟(ruan)件，能(neng)夠自動進行數據分(fen)析(xi)並生成(cheng)各(ge)種報告。通過內置的(de)軟件，用(yong)戶可(ke)以(yi)輕松(song)實(shi)現(xian)數據的(de)定量(liang)、相(xiang)對定量(liang)分(fen)析，以(yi)及標(biao)準(zhun)曲(qu)線的(de)繪制(zhi)和(he)結(jie)果(guo)的(de)統計分(fen)析(xi)。

 

　　四、應(ying)用(yong)優勢

 

　　1.高(gao)靈敏(min)度：具(ju)備(bei)高(gao)的(de)檢測靈敏(min)度，可(ke)以(yi)精(jing)確測量(liang)低(di)濃度的(de)DNA或RNA樣(yang)本(ben)，適(shi)用於(yu)微量樣本(ben)的(de)定量(liang)分(fen)析。

 

　　2.操作(zuo)簡便(bian)：其(qi)友好的(de)用戶界(jie)面和智(zhi)能(neng)化(hua)的(de)軟件設(she)計，使(shi)得(de)操(cao)作(zuo)過(guo)程更(geng)加(jia)簡(jian)便(bian)易(yi)行，降(jiang)低(di)了(le)操作(zuo)人(ren)員(yuan)的(de)技(ji)術要求。

 

　　3.高(gao)通量檢測：支(zhi)持(chi)96孔(kong)板和(he)384孔(kong)板的(de)檢測，適(shi)合(he)大(da)規模(mo)樣本的(de)高(gao)通量檢測需(xu)求(qiu)，廣(guang)泛應(ying)用(yong)於(yu)臨(lin)床診斷、食品安(an)全(quan)、環(huan)境(jing)監測等(deng)領域(yu)。

 

　　4.精(jing)確的(de)定量(liang)結(jie)果(guo)：通過實(shi)時(shi)監測熒(ying)光信(xin)號變化(hua)，ABI7500能(neng)夠提供(gong)準確的(de)定量(liang)數(shu)據，為基(ji)因表(biao)達研(yan)究、病原(yuan)檢測等(deng)提(ti)供可(ke)靠依據。