我們(men)在進(jin)行(xing)二(er)手(shou)熒光定(ding)量PCR儀(yi)實驗時(shi)會(hui)遇(yu)到的3個(ge)參(can)數(shu)
二(er)手(shou)熒光定(ding)量PCR儀(yi)是壹(yi)種可以(yi)實(shi)時檢測(ce)核(he)酸擴增的技(ji)術,在PCR反應體(ti)系(xi)中(zhong)加(jia)入(ru)熒光基團,利用熒光信號(hao)的變化對(dui)PCR過(guo)程進(jin)行(xing)實(shi)時(shi)監(jian)控(kong),以此(ci)實(shi)現對(dui)初(chu)始(shi)模(mo)板(ban)的定(ding)量分(fen)析。無需(xu)參(can)比染(ran)料,無需(xu)定(ding)期校準(zhun),采(cai)用歸(gui)壹(yi)化算法,快速準(zhun)確(que)直觀的呈現實驗結(jie)果,用戶(hu)使(shi)用方便簡潔(jie)。我們(men)在做熒光定(ding)量PCR時(shi)提到(dao)的三個(ge)名(ming)稱(cheng):擴(kuo)增(zeng)曲(qu)線(xian),標準(zhun)曲線(xian),熔(rong)解(jie)曲(qu)線。
(1)擴增曲(qu)線:擴增(zeng)曲線(xian)有兩種展現形(xing)式,壹種是線(xian)性(xing),壹種是對(dui)數(shu)形(xing)式。我們(men)通常(chang)是用CT來(lai)推(tui)算樣品中樣(yang)品的濃度(du)。CT值越(yue)高說(shuo)明模板(ban)濃度(du)越(yue)低。上面(mian)也詳(xiang)細說(shuo)明了原(yuan)理(li),在這裏(li)就不(bu)過(guo)多(duo)贅述(shu)。
(2)標準(zhun)曲線(xian):將(jiang)已知濃度(du)的樣品(標準(zhun)品)經過(guo)梯(ti)度(du)稀(xi)釋後(hou)分(fen)別(bie)取樣(yang)進(jin)行(xing)熒光定(ding)量PCR,得(de)到(dao)的壹系列(lie)的Ct值,用這(zhe)個(ge)Ct值與(yu)Log模(mo)板數(shu)對(dui)應(ying)可以(yi)得(de)到(dao)壹(yi)個(ge)相關(guan)的曲線,我們(men)叫標(biao)準(zhun)曲線(xian)。可以(yi)用這(zhe)個(ge)標(biao)準(zhun)曲線(xian)中(zhong)的壹些(xie)參數(shu)來(lai)判(pan)斷這個(ge)熒光定(ding)量PCR體(ti)系(xi)的優劣(lie)。
(3)熔(rong)解(jie)曲(qu)線:Tm值,MeltingTemperature(解(jie)鏈(lian)溫(wen)度(du)),PCR雙鏈產(chan)物的退火(huo)溫(wen)度(du)。這(zhe)兩個(ge)圖(tu)是在熒光定(ding)量PCR結(jie)束後(hou),對(dui)產(chan)物進(jin)行(xing)逐步升溫(wen)時進(jin)行(xing)的監(jian)測(ce),可以(yi)看(kan)到在達到其解(jie)鏈(lian)溫(wen)度(du)時(shi),熒光信號(hao)會(hui)有壹(yi)個(ge)忽然(ran)的下(xia)降。我們(men)將(jiang)測(ce)得(de)的這個(ge)曲(qu)線叫(jiao)做熔(rong)解(jie)曲(qu)線。理(li)論上如果PCR得(de)到(dao)特異性產(chan)物則(ze)只(zhi)有壹(yi)個(ge)Tm值,在溶解(jie)曲(qu)線上表(biao)示只(zhi)有單(dan)峰(feng)存(cun)在。如果是多(duo)相峰(feng),那麽(me)可以(yi)判(pan)斷產(chan)物不(bu)是單(dan)壹(yi)的,發(fa)生了(le)非(fei)特異擴增(zeng)。