1、內(nei)標對熒(ying)光(guang)定量PCR儀的(de)影響

　　若在待(dai)測樣(yang)品中(zhong)加入已(yi)知起始拷貝(bei)數(shu)的內(nei)標，則(ze) PCR 反(fan)應變(bian)為(wei)雙(shuang)重 PCR，雙(shuang)重(zhong) PCR 反應 中(zhong)存在兩種模(mo)板(ban)之(zhi)間(jian)的幹擾和(he)競爭，尤(you)其當(dang)兩(liang)種模(mo)板(ban)的(de)起始拷貝(bei)數(shu)相差(cha)比較(jiao)大(da)時，這種競爭會(hui)表(biao)現得更(geng)為(wei)顯著。但(dan)由(you)於待(dai)測樣(yang)品的起始拷貝(bei)數(shu)是未(wei)知的，所(suo)以無法加入合適(shi)數(shu)量的(de)已(yi)知模(mo)板(ban)作(zuo)為(wei)內(nei)標。也(ye)正(zheng)是這個(ge)原(yuan)因(yin)，傳統定量方(fang)法雖然加(jia)入內(nei)標，但(dan)仍(reng)然只是(shi)壹(yi)種半(ban)定(ding)量的(de)方(fang)法。

　　2、熒(ying)光(guang)定量 PCR 無(wu)需(xu)內(nei)標定(ding)量

　　熒(ying)光(guang)定量PCR儀技術(shu)有(you)效地(di)解(jie)決(jue)了傳統定量只能(neng)終點檢(jian)測(ce)的(de)局(ju)限(xian)，實(shi)現了每(mei)壹(yi)輪循環 均(jun)檢(jian)測(ce)壹(yi)次(ci)熒(ying)光(guang)信號的(de)強(qiang)度(du)，並(bing)記(ji)錄在電腦(nao)軟(ruan)件(jian)之(zhi)中(zhong)，通過(guo)對每(mei)個(ge)樣品 Ct 值的計(ji)算，根(gen)據 標準(zhun)曲(qu)線獲得定量結(jie)果(guo)。實時熒(ying)光(guang)定量 PCR 無(wu)需(xu)內(nei)標是(shi)建立在兩個基礎(chu)之(zhi)上(shang)的(de)：

　　（1）Ct 值(zhi)的(de)高(gao)度重現性 PCR 循環在到達(da) Ct 值(zhi)所在的循環數(shu)時，剛剛(gang)進入真(zhen)正(zheng)的指(zhi)數(shu)擴(kuo)增期(qi)（對數(shu)期(qi)），此(ci)時微小(xiao)誤(wu)差(cha)尚(shang)未(wei)放大(da)，因此(ci) Ct 值(zhi)的重現性*，即同壹(yi)模(mo)板(ban)不(bu)同(tong)時間(jian)擴(kuo)增或同壹(yi)時間(jian)不(bu)同(tong)管(guan)內(nei)擴(kuo)增，得到的 Ct 值是(shi)恒定的(de)。

　　（2）Ct 值(zhi)與(yu)起始模板(ban)的(de)線性(xing)關(guan)系由(you)於 Ct 值(zhi)與(yu)起始模板(ban)的(de)對數(shu)存在線性關(guan)系，可利(li)用標準(zhun)曲(qu)線對未(wei)知樣品進行定量測(ce)定(ding)， 因此(ci)，實(shi)時熒(ying)光(guang)定量 PCR 是(shi)壹(yi)種采(cai)用外標準(zhun)曲(qu)線定(ding)量的(de)方(fang)法。

　　外標法定量和(he)內(nei)標法定量的(de)方(fang)法學比較(jiao)，得出的結論(lun)是(shi)：內(nei)標法作(zuo)為(wei)定(ding)量或(huo)半(ban)定(ding)量的(de)手(shou)段是(shi)不(bu)可(ke)靠(kao)的(de)，而外標準(zhun)曲(qu)線的(de)定(ding)量方(fang)法是壹(yi)種準(zhun)確的、值得信賴(lai)的科(ke)學(xue)方(fang)法。熒(ying)光(guang)定量PCR儀